发布时间：2024-07-17 浏览：170
本研究观察了二氧化硅微簇固化氢(H2-Silica)的抗黑素生成功效，H2-Silica是一种基于倍半硅氧烷的化合物，氢离子嵌入到笼状二氧化硅基质中，可对人类黑色素瘤细胞HMV-II的黑素生成和l -多巴酪氨酸酶反应的抑制作用。对HMV-II细胞进行3倍于0.65 J/cm2的UVA = 1.95 J/cm2紫外线- a (UVA)氧化应激。UVA照射后，HMV-II细胞产生的黑色素比未照射对照组多2.72倍。HMV-II细胞在UVA辐照前后分别用20ppm的H2-Silica或28.4 ppm的曲酸处理，其黑色素含量分别被抑制至12.2%或14.5%。也就是说，H2-Silica表现出与增白剂曲酸相当的功效。低剂量(1- 10ppm)的H2-Silica可阻止HMV-II细胞的黑素生成，即使高剂量(100- 1000ppm)的H2-Silica也不会改变细胞活力和凋亡。相反，曲酸在14- 28ppm或更高浓度时具有细胞毒性。通过显微镜观察，H2-Silica抑制了富含黑色素细胞的特性，如细胞肥大、细胞过程形成和细胞核外的黑色素生成。用L-DOPA和蘑菇酪氨酸酶进行的酶促实验表明，H2-Silica抑制UVA介导的黑色素形成，其原因是由于H2-Silica释放的氢气能够清除自由基和抑制L-DOPA-to- dopachrome氧化。因此，H2-Silica有可能防止黑色素的产生对抗UVA，并作为补充剂或化妆品的皮肤亮白成分。
倍半硅氧烷是由一系列Si-O-Si组成的三维结构化合物，是由甲基链、卤素链、乙烯基链或苯基链等官能团络合而发展起来的。在过去十年中，Flanagan等人制备了“二氧化硅氢化物微簇”，这是一种以倍半硅氧烷为基础的化合物，氢嵌入在笼状二氧化硅基体中，在水相中的氧化还原电位为−700 mV, pH约为8.7。（倍半硅氧烷是一种有机硅化合物，其化学式为[RSiO3/2]n（R=H，烷基，芳基或烷氧基）。倍半硅氧烷是无色固体，采用笼状或聚合结构，具有Si-O-Si键和四面体Si顶点。倍半硅氧烷是多八面体倍半硅氧烷（POSS）的一种，作为陶瓷材料和纳米复合材料的前驱体引起了人们的关注。不同的取代基（R）可以连接到Si中心。这些分子是不寻常的，因为它们具有无机硅酸盐核和有机表面。硅芯具有刚性和热稳定性。）
据报道，“二氧化硅氢化物微簇”可以保持细胞的活力，因为光敏化可以中和自由基如单线态氧、羟基自由基和超氧阴离子。众所周知，氧化应激在紫外线a (UVA)介导的黑色素细胞生成中发挥作用，但抗氧化剂通过保持细胞氧化还原平衡来防御它。尽管黑色素本质上是生物合成的，以防止紫外线引起的皮肤损伤，但在皮肤美白方面，一直是不受欢迎的问题。最近，抗氧化剂已被应用于皮肤护理，我们以前曾报道过氢气溶解在培养基或其他抗氧化剂中可以清除细胞内活性。本研究假说为H2-Silica能对抗紫外线导致的皮肤细胞黑色素产生，从而产生皮肤美白作用。
2.3. H2-Silica溶液的制备。H2-Silica分散在浓度为1650ppm的反渗透超纯水中。假设1650ppm的浓度为人体每日摄入0.165 mg/mL，人体体重为60kg / 血液5L。在10至120分钟内，H2-Silica溶液的溶解氢水平稳定在0.36 -0.52 ppm，然后在300分钟内用溶解氢(DH)仪测量时逐渐下降到0.1 ppm。使用ORP仪测量，氧化还原电位(ORP)在−722 ~−718 mV范围内。pH值为9.38 ~ 9.70，溶解氧(DO)为8.73 ~ 4.91，用pH/DO仪测定。H2-Silica溶液的这些参数在制备后立即连续测量300分钟，如图1所示。在每次实验中，H2-Silica溶液都是在使用前立即制备。
3．1. 采用Masson-Fontana氨银染色评估HMV-II细胞的黑色素生成。基本以24小时为连续UVA-irradiation 0.65 J / cm2(总:1.95 J / cm2)间隔一个小时，在黑暗HMV-II细胞黑色素是褐黑色颗粒(图2)。
使用NIH的图像软件进行分析。图4显示了生物合成的黑色素在HMV-II细胞中的分布和数量。
UVA刺激黑色素生成的水平(图4)。
３.２ 体外酪氨酸酶催化黑色素产生的第一步，即酪氨酸生成L-DOPA，并将L-DOPA氧化为在黑色素生成中起重要作用的多巴醌。在L-DOPA酪氨酸反应中测试了H2-Silica或其他知名的美白成分在相同剂量10ppm下的抑制作用20分钟。如图5和6所示，H2-Silica比其他试剂明显减少了黑色素的形成。当用10 ppm的H2-Silica、曲酸、abrutin、对苯二酚、l -半胱氨酸、氨甲环酸和抗坏血酸处理时，75单位/mL酪氨酸酶催化的黑色素量。
不存在酪氨酸酶情况下，在450nm处的吸光度未检测到黑色素的形成，意味着在这个试验系统自动氧化多巴醌并不影响结果(图6)。大量黑色素产生40分钟L-DOPA-酪氨酸反应是观察到的剂量依赖性的方式增加酪氨酸酶在0 - 100单位/毫升(图7 (a))，在15分钟这是与酪氨酸剂量成正比(图7 (b))。酪氨酸酶在12.5-100单位/mL的酪氨酸酶和0.075%的L-DOPA反应15分钟后，酪氨酸酶的抑制率为74.9±4.9%(图7(b))。
孵化时间最初15分钟黑色素酪氨酸酶催化0 - 100单位/毫升比例增加，然后达到一个高原孵化15 - 40分钟内，表明L-DOPA-酪氨酸反应是左旋多巴的剂量0.075%限速反应在这个测试(图8)。
本研究旨在研究H2-Silica对HMV-II细胞黑色素合成的抑制作用以及体外蘑菇酪氨酸酶对L-DOPA的酶促反应。分次UVA照射刺激HMV-II细胞产生黑色素，但UVA照射前后的条件培养基中H2-Silica处理阻止了细胞黑色素的超生成(图2)。低剂量(1-10 ppm)的H2-Silica可以阻止HMV-II细胞的黑色素生成。细胞生长没有影响(图2)。相反，曲酸是细胞毒性的浓度14-28 ppm或更多(数据未显示)。虽然曲酸是一种流行的皮肤美白成分，它能引起皮炎，敏感或红斑。我们的结果表明，与曲酸相比，H2-Silica可作为一种具有相对生物安全性的抗黑素生成试剂。数据表明，UVA-irradiation 0.65 J / cm2 HMV-II细胞中的黑色素含量增加2.72倍(图4)。然而，当HMV-II细胞治疗H2-Silica 20 ppm或曲酸的28.4 ppm，黑色素形成的百分比分别被抑制到12.2%或14.5%(图4)。
因此，H2-Silica对HMV-II细胞黑色素形成的抑制作用与曲酸相当。通过显微镜观察，UVA照射的细胞显示了一些典型的黑素细胞属性，如纺锤状形态和细胞核外的超黑素生成，而H2-Silica处理的细胞显示了上皮样形态和抑制黑素生成(图3)。我们比较了H2-Silica对体外左旋多巴-酪氨酸酶反应的抑制作用，并与著名的皮肤美白成分进行了比较。当皮肤暴露在紫外线辐射下，黑色素生成是由酪氨酸酶的激活介导的，酪氨酸酶是黑色素生成的关键酶。因此，蘑菇酪氨酸酶通常被用作筛选潜在的靶标酶潜在的黑色素生成抑制剂，抑制酪氨酸酶活性是皮肤最常见的靶标。图5和图6所示的结果表明10 ppm H2-Silica呈现出较强的抑制作用，比其他皮肤美白效果更好。与UVA辐射对照相比，H2-Silica处理抑制酪氨酸酶催化的黑色素形成为13.1±1.0%，但其他皮肤美白试剂的抑制范围为64.6±1.3%-109.8±2.4%(图6)。
我们估计H2-Silica对L多巴-酪氨酸酶反应的抑制作用与酪氨酸酶的剂量或反应时间有关。因此，10 ppm的H2-Silica抑制UVA介导的黑色素形成。由于酪氨酸酶活性的下调。H2-Silica处理细胞中黑色素形成的数据与L-DOPA-酪氨酸抑制酪氨酸酶活动密切相关的反应。众所周知,黑色素的产生及其分布在人体皮肤被紫外线强烈影响。有人报道细胞色素组成的黑色素过氧化物更多。然而，抗氧化剂通过其抗氧化作用阻止紫外线诱导的超黑素生成。弗拉根等发现H2-Silica在水中不与水剧烈反应，逐步分解聚合硅酸盐单体，氢释放进入水相。在我们的研究中，H2-Silica具有抗氧化能力，即浓度为1650ppm的溶液在0.36 ~ 0.52 ppm时表现出稳定的溶解氢水平，120分钟内氧化还原电位(ORP)为−757 ~−722 mV。和碱性pH值8.85∼9.70状态(图1)。蘑菇酪氨酸酶的最佳pH值是pH值7.0和80%以上的最大活动是维护范围内的pH值6.0∼8.5.23解决H2-Silica中和了0.2米磷酸钾缓冲(pH值6.8)和应用在测试中。我们有理由假设H2-Silica的抗黑素生成特性主要归因于自由基清除和H2-Silica释放氢抑制L-DOPA氧化(图1)，尽管部分原因是二氧化硅的防晒作用和氢对HMV-II细胞的超强渗透性。我们以HMV-II细胞为实验对象，利用多巴酪氨酸酶反应法对新型纳米材料H2-Silica的抗黑素作用进行了定量分析。细胞提取物中黑色素含量的定量分析很重要，但由于黑色素提取效率的波动和黑色素提取液中水分含量的变化，定量分析并不一定准确。
我们之前已经证实，使用NIH Image软件计算出的黑色素量与细胞中的黑色素含量相关因此，与传统皮肤美白成分相比，H2-Silica表现出更强作用。研究结果表明，H2-Silica对UVA介导或酪氨酸酶催化的黑色素形成具有抑制作用，可作为化妆品的候选美白剂。H2-Silica抑制酪氨酸酶的动力学模式有待进一步研究。氢思语：硅化材料释放氢气的概念是美国伊朗裔提出的概念，这种产品已经有许多年的销售，也有一些研究论文，早期只有发明者本人的工作，属于孤证。最近日本学者也有一些验证性的研究数篇。虽然不多，但也能说明这一概念有三方验证。Kato S, Saitoh Y, Miwa N. Inhibitions by hydrogen-occluding silica microcluster to melanogenesis in human pigment cells and tyrosinase reaction[J]. Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 2013, 13(1): 52-59.
文章出自氢思语微信公众号
作者：孙学军
上海交通大学氢医学教研室副教授、硕士生导师
第二军医大学海军航空医学教研室教授
我国氢气医学带头人
